T7EndonucleaseI(T7EI)在CRISPR/Cas9基因編輯中的應用主要體現在突變體檢測和基因編輯效率評估上。以下是T7EI在CRISPR/Cas9中的具體應用步驟和特點：1.**基因編輯效率評估**：-T7EI用于評估CRISPR-Cas9在給定的導向RNA靶位點上對細胞群體進行基因編輯的效率。-通過PCR擴增圍繞CRISPR導向RNA靶位點的基因組DNA，如果CRISPR-Cas9介導的非同源末端連接（NHEJ）修復事件引入了突變，變性和退火將形成突變型和野生型PCR擴增子的異源雙鏈DNA。2.**突變體檢測**：-如果CRISPR/Cas9編輯成功在DNA上引入突變，則可與野生型DNA片段退火產生異質雙鏈DNA。T7EI可以識別該DNA上的不完全配對的DNA位點然后進行雙鏈切割，通過瓊脂糖凝膠電泳即可顯示酶切后的條帶，從而半定量判定基因編輯效果。-T7EI能識別長度大于或等于2bp的插入、缺失或突變導致的錯配DNA，不能識別1bp的插入、缺失或突變。3.**實驗步驟**：-收集細胞并提取基因組DNA，然后使用PCR擴增期望編輯的基因組區域。擴增子的長度建議為0.5-1kb。-對擴增的DNA進行變性和退火復性，以產生異質雙鏈DNA。-使用T7EI酶處理退火后的DNA產物，在37℃孵育15分鐘。

Cre重組酶在基因編輯中的操作主要涉及以下幾個步驟：1.**識別與結合**：-Cre重組酶首先識別并分別結合兩個LoxP序列的兩個反向重復序列，形成一個二聚體。2.**四聚體形成**：-兩個二聚體互相靠近，形成由四個Cre分子與兩個LoxP位點結合形成的四聚體復合物。3.**DNA切割與交換**：-Cre重組酶在每個LoxP位點的間隔序列中引導單鏈切割，產生帶有3’端羥基的斷裂。每個LoxP位點的兩個單鏈分別被切割。切割產生的自由3’端與對側的3’端進行交換和重連，形成Holliday交叉結構。4.**分子重組與解旋**：-Holliday交叉結構通過Cre酶的作用被解旋并重組，形成新的重組產物。這個過程導致兩個LoxP位點之間的DNA序列被刪除、反轉或易位，具體效果取決于LoxP序列的排列方式（方向和位置）。5.**條件性基因編輯**：-通過建立特異性Cre小鼠，該小鼠中的Cre重組酶由特定啟動子驅動，可在特定細胞或組織或全身表達Cre重組酶。與帶有Lox位點的Flox小鼠雜交，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，實現條件性基因打靶（表達或敲除靶基因）。Recombinant Cys-Protein G 重組蛋白GCas12a還可以高效地在一些重要的工業鏈霉菌菌株中產生編輯，這些菌株由于毒性而不能使用SpCas9進行編輯。

BsuDNAPolymerase(LargeFragment,5U/μL)是一種來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的DNA聚合酶。這種酶保留了BsuDNAPolymeraseI的5'-3'聚合酶活性，但缺失了5'-3'核酸外切酶結構域，因此它具有鏈置換活性，可以用于重組酶聚合酶擴增（RPA）等恒溫擴增技術。以下是BsuDNAPolymerase(LargeFragment,5U/μL)的一些關鍵特性和應用：1.**活性定義**：在37°C條件下，30分鐘內將10nmol的dNTP摻入酸不溶性物質所需的酶量定義為1個活性單位（U）。2.**熱失活條件**：75°C，20分鐘。3.**酶保存液成分**：25mMTris-HCl,50mMNaCl,1mMDTT,0.1mMEDTA,50%Glycerol,pH7.4@25°C。4.**儲存條件**：-25~-15°C保存，有效期2年。5.**注意事項**：-由于缺乏3'-5'核酸外切酶活性，BsuDNAPolymerase(LargeFragment)不能切除3'未配對的突出末端，因而不適用于生成平齊末端。-25°C時BsuDNAPolymerase(LargeFragment)保留50%的活性，是同溫度下Klenow片段(3'-5'exo-)的兩倍。6.**應用**：-隨機引物法標記。-cDNA第二條鏈的合成。-單個dA的加尾。-鏈置換的DNA合成。

DNA片段大小對磁珠法DNA凝膠回收試劑盒的回收率有影響。根據搜索結果，我們可以得出以下結論：1.**小片段DNA（小于200bp）**：對于小于200bp的DNA片段，回收率會下降。這是因為小片段的DNA與固相基質的結合力相對較弱，因此相對損失較大，導致回收率降低。在某些情況下，小于100bp的DNA片段的回收率可能只有30-60%。2.**中等大小片段DNA（200bp-4kb）**：在這個范圍內的DNA片段，通常回收率較高，可以達到80-95%。這是因為這些片段大小適中，既不會因太小而損失，也不會因太大而難以洗脫。3.**大片段DNA（大于4kb）**：對于大于4kb的DNA片段，回收率也會下降，通常在30-50%之間。這是因為大片段的DNA與固相基質的結合力更強，因此更難洗脫。4.**片段大小與回收率的關系**：DNA片段越大，和固相基質的結合力越強，就越難洗脫，回收率就越低。相反，DNA的量越少，相對損失越大，回收率也越低。5.**操作技巧**：為了提高回收率，可以采取一些操作技巧，比如減少切膠體積、確保溶膠徹底、使用合適的洗脫液體積和pH值等。

T5核酸外切酶在基因克隆中的優勢主要體現在以下幾個方面：1.**高效性**：T5核酸外切酶依賴性組裝（TEDA）方法在常規克隆中的效率與使用專有DNA聚合酶的商業In-Fusion方法相似，但高于使用T5核酸外切酶、PhusionDNA聚合酶和DNA連接酶的Gibson方法。2.**低成本**：TEDA方法每個反應使用0.04U的T5核酸外切酶，價格為0.25美分，具有很高的成本效益。3.**簡單性**：TEDA方法的反應混合物非常簡單，易于操作，這使得它在預算有限的實驗室中尤其有用。4.**靈活性**：TEDA方法能夠組裝多個DNA片段，并在多個位點同時進行定點誘變，提供了一種靈活的克隆和突變方法。5.**陽性克隆率**：使用T5核酸外切酶的無縫克隆技術可以確保100%的陽性克隆率，這提高了實驗的成功率。6.**協同作用**：在無縫克隆中，T5核酸外切酶與Phusion高保真DNA聚合酶和TaqDNA連接酶協同作用，通過切割、填補和連接三個步驟，高效地完成DNA片段的連接。7.**減少污染**：T5核酸外切酶可以降解堿裂解提取質粒中的變性DNA，減少超螺旋DNA的污染，提高DNA克隆和轉染效率。這些優勢使得T5核酸外切酶成為基因克隆中一個非常有價值的工具，尤其是在需要高效、低成本和操作簡便的實驗環境中。Pfu DNA Polymerase與Taq酶的對比：與Taq酶相比，Pfu DNA Polymerase的錯誤率更低，適合高精度實驗。Exendin-4

Endo H 相對比較嬌貴，需要在特定的條件下保存才能保持其活性，一般需要在 - 20℃或更低溫度下保存。Recombinant Human CLEC10A Protein,His Tag

牛痘DNA拓撲異構酶I（VacciniaVirusDNATopoisomeraseI）與細菌DNA拓撲異構酶的主要區別如下：1.**來源不同**：-牛痘DNA拓撲異構酶I來源于牛痘病毒，是一種真核生物病毒中的酶。-細菌DNA拓撲異構酶則來源于原核生物，如大腸桿菌的ω蛋白等。2.**功能特性**：-牛痘DNA拓撲異構酶I能夠解旋DNA的超螺旋結構，并且識別并切割雙鏈DNA末端[5’C(T)CCTT]，與DNA形成共價連接形成穩定復合物，遇到DNA的5’-OH基團后，重新連接形成完整DNA鏈。-細菌DNA拓撲異構酶，如大腸桿菌的ω蛋白，主要功能是催化DNA鏈斷開和結合的偶聯反應，以改變DNA的拓撲結構。3.**活性條件**：-牛痘DNA拓撲異構酶I即使在Mg2+不存在的條件下也顯示活性。-細菌DNA拓撲異構酶可能需要Mg2+等金屬離子作為輔因子來發揮活性。4.**作用的DNA鏈**：-牛痘DNA拓撲異構酶I能使正負兩方的超螺旋分子均形成松散型。-原核生物由來的DNA拓撲異構酶I只作用負鏈的超螺旋分子。5.**共價鍵形成**：-牛痘DNA拓撲異構酶I與DNA形成共價連接，此酯鍵中所貯存的能量可能在切斷端的再結合上起著作用。-細菌DNA拓撲異構酶在原核生物中是游離型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端與酶形成共價鍵。

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