使用RFect系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞接種：一般做轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml），使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%；如果細(xì)胞是原代細(xì)胞，接種密度可以密一些，細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml；懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml），待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果，靠前次使用建議您用24孔板做，每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將較佳轉(zhuǎn)染條件（siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例）放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可用70％的酒精沖洗凍存管，然后擦去多余酒精。成都正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商

原代細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)及作用：1.細(xì)胞壁（CellWall）【動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有】位于植物細(xì)胞的外層,是一層透明的薄壁。它主要是由纖維素和果膠組成的，孔隙較大，物質(zhì)分子可以自由透過(guò)。細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞起著支持和保護(hù)的作用。2.細(xì)胞膜（CellMembrane)細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)緊貼著一層極薄的膜，叫做細(xì)胞膜。這層由蛋白質(zhì)分子和磷脂雙層分子組成的薄膜，水和氧氣等小分子物質(zhì)能夠自由通過(guò)，而某些離子和大分子物質(zhì)則不能自由通過(guò)，因此，它除了起著保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部的作用以外，還具有控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的作用：既不讓有用物質(zhì)任意地滲出細(xì)胞，也不讓有害物質(zhì)輕易地進(jìn)入細(xì)胞蕪湖正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒產(chǎn)品介紹原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和部位后立即進(jìn)行培養(yǎng)。

保存條件：-20℃保存，一年有效。其中臺(tái)盼藍(lán)染色液也可以4℃保存，PMSF(晶體)和PMSF(溶劑)在配制成100mMPMSF溶液前可以室溫保存。注意事項(xiàng)：1.試劑盒中的試劑對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟槐厝渴褂谩?.如果不是用于制備線粒體蛋白樣品，線粒體分離試劑和線粒體裂解液中不必加入PMSF。3.如果用于制備線粒體蛋白樣品，線粒體分離試劑和線粒體裂解液中需添加PMSF。PMSF一定要在線粒體分離試劑或線粒體裂解液加入到樣品中前4.2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。5.分離線粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷。6.通常在分離線粒體時(shí)前后兩次離心速度選取600g和11,000g，如果希望純度更高，但對(duì)線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用1000g和3500g

原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)步驟為：1）將動(dòng)物組織從機(jī)體中取出并消毒除去存留在組織上的細(xì)菌、細(xì)菌、等污染源，這些污染源將會(huì)所需培養(yǎng)的原代細(xì)胞凋亡、停止生長(zhǎng)和繁殖直至死亡，因此整個(gè)原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中較全在無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行。2）將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘，通常在37C水浴里進(jìn)行，而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細(xì)胞的類(lèi)型，比如成骨、肌肉、心、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個(gè)細(xì)胞，但是對(duì)于腦組織和乳腺等軟組織，就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶，以免損傷分散出來(lái)的單個(gè)細(xì)胞。可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h。

膠原酶的配制：建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶，相關(guān)文章也蠻多的）膠原酶消化時(shí)間：根據(jù)組織特性，消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例，加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細(xì)小，時(shí)間可以短一些，30min左右即可）。原代細(xì)胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和胰酶給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類(lèi)似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用。金華原代細(xì)胞分離試劑盒推薦廠家

會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。成都正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商

原代細(xì)胞的小知識(shí)：1.解凍原代細(xì)胞對(duì)解凍過(guò)程非常敏感，因此將小瓶置于37℃水浴鍋中，保持并輕輕旋轉(zhuǎn)直到內(nèi)容物剛剛解凍是很重要的。然后應(yīng)立即從水浴中取出小瓶，并轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作臺(tái)。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準(zhǔn)備就緒，以便可以立即用于接種細(xì)胞，并置于培養(yǎng)箱中，我們?cè)谑褂胏ellsystems的原代視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，復(fù)蘇的時(shí)候沒(méi)有去離心，第二天換個(gè)液就可以。2.傳代原代細(xì)胞有間隙克制接觸不良反應(yīng)，所以細(xì)胞不能到達(dá)100%的密度的時(shí)候傳代，一般較有效的建議觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，CellSystems的原代細(xì)胞在細(xì)胞密度達(dá)到85%左右的時(shí)候傳代較佳，當(dāng)生長(zhǎng)至100％匯合時(shí)，它就會(huì)衰老。記住，所有的原代細(xì)胞不是100％純，因此我們要盡量減少污染細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳代時(shí)，使用低濃度的胰蛋白酶，也可以嘗試下cellsystems的整體消化套裝哦（品牌：cellsystems，貨號(hào)：4Z0-800）并在顯微鏡下密切監(jiān)測(cè)細(xì)胞。此外，記得在胰蛋白酶消化后完全中和細(xì)胞中的胰酶，因?yàn)槿魏位钚缘囊鹊鞍酌付紝p傷細(xì)胞成都正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商