原代細胞轉染操作步驟(以24孔培養板為例):A.細胞接種:轉染前現在接種細胞,每孔500μl培養基(不可加物品),使細胞在轉染時密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物準備:1.6pmolsiRNA用50μl無血清培養基稀釋。2.2μlRFectPM用50μl無血清培養基稀釋。輕輕混勻,室溫孵育5min。注意:確保在25min內執行第三步操作,不要過于延遲。3.孵育5min后,將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合(總體積100μl)。輕輕混勻,室溫孵育20min。C.將混合物加到培養的細胞內(完全培養基培養):1.將100μl混合物加入培養孔內,培養孔內含有0.5ml培養的細胞。輕輕晃動培養板,混勻。2.37°C培養18-72h,檢測基因克制效果。如果需要,細胞培養4-6h時可以更換培養基,但不是必須。孵育時間的長短,取決于細胞類型、所干擾基因本身及分析方法。可設置不同的孵育時間進行實驗以確定較佳孵育時間。轉染實驗優化:為了提高轉染效率,較好對轉染條件進行優化,特別是開始使用。用70%的酒精沖洗凍存管,然后擦去多余酒精。南京原代細胞分離試劑盒哪家好
使用RFect系列小核酸轉染試劑做siRNA/miRNA轉染測實驗注意事項:1.細胞接種:一般做轉染前現在接種/鋪板(細胞計數大約5*10^4cell/ml),使做轉染前細胞密度在30-50%;如果細胞是原代細胞,接種密度可以密一些,細胞計數在2*10^6cell/ml;懸浮細胞可以在轉染當天接種/鋪板(細胞計數大約5*10^4cell/ml),待細胞狀態穩定后做轉染前細胞密度30-40%。2.為了能在使用時有較好的轉染效果,靠前次使用建議您用24孔板做,每孔2ul轉染試劑即可。將較佳轉染條件(siRNA與轉染試劑的用量、比例)放大到對應的孔板即可徐州正規原代細胞分離試劑盒價格給懸浮培養的細胞換液時要注意不要吸出細胞。
取材的基本要求和注意事項敘述如下:一、取材的基本要求(1)取材要注意新鮮和保鮮新鮮組織易于培養成功,取材時應盡量在4~6h內能制作成細胞,盡快入箱培養,若不能即時培養,應將組織浸泡于培養液內,于4℃存放。若組織塊較大,應在除去表面血塊、壞死組織、脂肪和結締組織后,切碎于培養液內4℃存放,但時間不能超過24h。對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應加入含10%二甲基亞砜的培養基,按細胞凍存方式于液氮中冷凍保存。(2)取材應嚴格無菌所取標本材料應在無菌條件下進行,為了確保無菌,對所取材料若疑有污染的可能,應將所取組織在含高濃。
原代細胞的培養和維持:(1)原代細胞的培養方法原代細胞的培養也叫初代培養是從供體取得組織細胞在體外進行的開始培養,是建立細胞系的靠前步,是一項基本技術。原代細胞較接近和較能反映體內生長特性,適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。①組織塊培養法組織塊培養是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養瓶(或皿)中,瓶壁可預先涂以膠原薄層,以利于組織塊粘著于瓶壁,使周邊細胞能沿瓶壁向外生長。應用于大規模藥物篩選,越來越多地用于更可靠地研究生命科學。
細胞傳代的方法都有哪些:根據不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代;部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代;懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。原代培養的開始傳代應注意的問題?細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,不要急于傳代;原代培養時細胞多為混雜生長,不同的細胞有不同的消化時間,因此要根據需要注意觀察及時處理,并根據不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞;吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷;開始傳代時細胞接種數量要多一些,使細胞能盡快適應新環境而利于細胞生存和增值;隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養瓶。多數細胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個細胞。廣州原代細胞分離試劑盒廠家批發價
原代內皮細胞和血管平滑肌細胞都需要添加L-谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子。南京原代細胞分離試劑盒哪家好
細胞培養注意事項及常見問題解答:傳代1、貼壁細胞傳代時,先用消化液潤洗一遍;棄掉后,再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化;當細胞變圓,彼此之間產生空隙,加入等量或大量的培養基終止消化,培養基中的血清可以克制胰蛋白酶的活性。2、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度,并不是說濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差,會破壞細胞膜成分。PH8.0,37度環境下,消化液的消化能力是較強的。培養基中的血清會降低胰酶的消化能力,所以每次消化前,也要用PBS反復沖洗干凈培養皿。日常用的比較多的消化液濃度:a)0.25%胰蛋白+0.02%EDTA。南京原代細胞分離試劑盒哪家好
原代細胞的培養和維持:1.消化培養法2.懸浮細胞培養法對于懸浮生長的細胞,如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的細胞和免疫細胞無需消化,可采用低速離心分離,直接培養,或經淋巴細胞分層液分離后接種培養。3.部位培養部位培養是指從供體取得部位或組織塊后,不進行組織分離而直接在體外的特定環境條件下培養,部位培養可保持部位組織的相對完整性,可用于重點觀察細胞間的聯系、排列情況和相互影響,以及局部環境的生物調節作用。具有體內組織特異性特征并且純度高。鄭州正規原代細胞分離試劑盒服務電話取材的基本要求和注意事項敘述如下:一、取材的基本要求(1)取材要注意新鮮和保鮮新鮮組織易于培養成功,取材時應盡量...