原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項：原代內(nèi)皮細(xì)胞提取：1)整個操作要在潔凈通風(fēng)的超凈臺下進行，所有的器材要高壓消毒。2)根據(jù)BALB/c小鼠的體重，用10ml/kg3%濃度的戊巴比妥鈉麻醉；將小鼠置于盛有75%乙醇的燒杯內(nèi)，這一步不僅可以消毒，也可以讓小鼠體毛浸濕，后續(xù)剃去皮毛的時候不會沾到剪刀或組織上。3)用鑷子輕輕挑起小鼠的心臟，裝有PBS的注射器插入心尖，同時在右心耳處剪開一個小口，緩慢推動注射器，隨著心臟的跳動，將體內(nèi)的血液沖洗出來。4)取出小鼠的肺部組織，將肺組織切成小米粒樣的大小，置于預(yù)冷的HBSS中反復(fù)沖洗幾次。5)將小米粒大小的肺組織置于培養(yǎng)瓶中（培養(yǎng)瓶前現(xiàn)在用1%明膠溶液包被培養(yǎng)面，4度過夜，小鼠處理前，將培養(yǎng)瓶放置培養(yǎng)箱中，使其溫度恢復(fù)至37度），置于培養(yǎng)箱37度的環(huán)境下，消化4個小時。可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h。貴陽原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商

原代細(xì)胞如何傳代接種：原代細(xì)胞（primaryculturecell）是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅普遍應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株（系）研究、DNA，RNA和遺傳學(xué)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、藥物的研究等。原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用，市場前景廣闊。原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細(xì)胞、組織和部位后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把靠前代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商用多聚賴氨酸（或參照說明書）包被培養(yǎng)瓶。

原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：從組織制備原代細(xì)胞，即使捱過了極其嚴(yán)苛的解離步驟，不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆蛛x操作可能會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢、表型不一致甚至細(xì)胞污染，特別是由于組織中可能含有細(xì)菌等微生物，污染問題對于原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)是一個很大的隱患。而為了讓研究人員不再為這些問題頭疼，現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了一些細(xì)胞公司可供應(yīng)現(xiàn)成的原代細(xì)胞，并對應(yīng)配有充分優(yōu)化的培養(yǎng)基和實驗方案，這使得原代細(xì)胞的培養(yǎng)和研究比以往要輕松得多。而對于具備自主從組織中獲取原代細(xì)胞的實驗室，也建議以商業(yè)化的原代細(xì)胞作為對照，采用均一性和穩(wěn)定性更好的P2/P3代次進行實驗，并用專門的原代細(xì)胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，較大限度提高原代細(xì)胞的生長。

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟（以24孔培養(yǎng)板為例）：A.細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種細(xì)胞，每孔500μl培養(yǎng)基（不可加物品），使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物準(zhǔn)備：1.6pmolsiRNA用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。2.2μlRFectPM用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻，室溫孵育5min。注意：確保在25min內(nèi)執(zhí)行第三步操作，不要過于延遲。3.孵育5min后，將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻，室溫孵育20min。C.將混合物加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）：1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi)，培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細(xì)胞。輕輕晃動培養(yǎng)板，混勻。2.37°C培養(yǎng)18-72h，檢測基因克制效果。如果需要，細(xì)胞培養(yǎng)4-6h時可以更換培養(yǎng)基，但不是必須。孵育時間的長短，取決于細(xì)胞類型、所干擾基因本身及分析方法。可設(shè)置不同的孵育時間進行實驗以確定較佳孵育時間。轉(zhuǎn)染實驗優(yōu)化:為了提高轉(zhuǎn)染效率，較好對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化，特別是開始使用。必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。可以通過增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。

原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：原代細(xì)胞是出了名的難養(yǎng)，對培養(yǎng)環(huán)境和實驗操作的要求更苛刻。原代細(xì)胞在體外通常只能傳代少數(shù)幾次，某些原代細(xì)胞（如神經(jīng)元細(xì)胞）甚至無法進行傳代。對于研究人員來說，如何才能經(jīng)濟高效地培養(yǎng)好原代細(xì)胞，并圍繞這有限幾次傳代的細(xì)胞設(shè)計實驗，是更大的一個挑戰(zhàn)。原代細(xì)胞是取材于切除的動物組織，通過酶處理，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)直至達到足夠的數(shù)量。分離的原代細(xì)胞有兩種類型：貼壁細(xì)胞（錨定依賴性生長）和懸浮細(xì)胞（錨定非依賴性），貼壁細(xì)胞多來自部位組織，而懸浮細(xì)胞多來自血液系統(tǒng)的細(xì)胞。使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌)。廈門正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒生產(chǎn)廠家

大多數(shù)組織可以制備原代細(xì)胞，但生長的快慢及難易程度不一。貴陽原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商

原代細(xì)胞的獲取：酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶。膠原酶的配制：建議看相關(guān)的文獻進行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會加入胰酶，相關(guān)文章也蠻多的）膠原酶消化時間：根據(jù)組織特性，消化時間會有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例，加入膠原酶Ⅰ進行消化后，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細(xì)小，時間可以短一些，30min左右即可）。貴陽原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商

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